Goutte épaisse et frottis

QBC et Dip-stick

Sérologie

Biologie

7.1 DIAGNOSTIC CLINIQUE

C'est la constatation d'un accès fébrile, décrit classiquement avec sa périodicité et sa séquence: frissons, chaleur et transpiration.

En zone d'endémie, l'immunité et les infections mixtes embrouillent le tableau clinique. La difficulté vient des parasitémies asymptomatiques.

En pathologie d'importation, la profession, les notions de voyage récent et d’interruption prématurée d’une chimioprophylaxie doivent faire envisager ce diagnostic. L'éventualité du paludisme chez les voyageurs à leur retour est généralement ignorée.

7.2 LE DIAGNOSTIC SPECIFIQUE

Les techniques de diagnostic actuellement en usage comprennent la mise en évidence de parasites dans le sang et la titration des anticorps antiplasmodium dans le sérum.

Actuellement à l'étude, la détection d'antigène plasmodial dans le sang total à l'aide d'anticorps monoclonaux ou le repérage d'ADN plasmodial par hybridation avec des sondes marquées ou après amplification du type "polychain reaction” (PCR) détrôneront peut-être les méthodes microscopiques traditionnelles, éprouvées mais imparfaites et exigeant, pour être effectuées correctement, un personnel suffisamment expérimenté.

Microscopie: la goutte épaisse et le frottis

Sur ces techniques seules, repose actuellement le diagnostic de certitude.

Pour les parasites sanguicoles, la mise en évidence du parasite se fait habituellement par l'examen au microscope d'une goutte épaisse (GE) et d'un frottis de sang colorés au Giemsa. Dans la GE, les éléments du sang sont concentrés sur une surface beaucoup plus petite que dans le frottis, ce qui accélère la recherche. La destruction des érythrocytes rendra la reconnaissance des parasites plus difficile mais le gain de sensibilité par rapport au frottis est d'environ 20 fois. On peut estimer que l'examen de 100 champs microscopiques (oculaire X10, objectif X100) correspond à un volume examiné de 0,25 µl.

Le frottis est indispensable pour le diagnostic d'espèce avec répercussion sur le traitement: pour P. falciparum, complications possibles et résistance probable aux traitements habituels; pour P. vivax et P. ovale, existence de rechutes ( hypnozoïtes insensibles aux traitements usuels de l'accès); pour P. malariae, complications rénales .

Il faut signaler l'existence fréquente d'infections mixtes où P. falciparum est accompagné de P. vivax, P. ovale ou P. malariae.

Goutte épaisse

L'examen de la GE peut détecter des parasitémies de 10-20 parasites par µl.

La numération parasitaire se fait en comptant le nombre de parasites par 200 leucocytes. On admet que la leucocytémie moyenne est de 6000 par µl. En multipliant le nombre de parasites comptés par 30, on obtient une approximation du nombre de parasites par µl.

Une méthode plus rapide consiste à compter, dans 100 champs microscopiques, le nombre de champs contenant un ou des parasites. Le résultat est exprimé en pourcentage de champs positifs. Il a été calculé qu'à partir de 500 parasites par µl, tous les champs contiennent au moins 1 parasite.

Frottis

L'examen des frottis permet de détecter des parasitémies de l'ordre de 200 parasites par µl.

Dans le frottis, l'utilisation d'un oculaire quadrillé, permettra la numération des globules rouges parasités par champ. Le rapport de ce nombre sur le nombre total d' hématies par champ donne le pourcentage d'hématies parasitées et donc le nombre de parasites par µl, en admettant que le nombre normal de globules rouges par µl soit de 4 à 5 millions. Si le sujet est très anémié, il faudra ajuster les valeurs mais l'approximation reste acceptable entre 3 et 5 millions de globules rouges par µl.

Sensibilité de l'examen microscopique :

Intérêt de la numération parasitaire

L'importance de la détermination de la densité parasitaire est relative: des sujets semi-immuns peuvent héberger des parasites du paludisme sans symptômes de maladie tandis qu'en l'absence d'immunité spécifique, toute présence de parasites dans le sang est à l'origine d'une pathologie aiguë en incubation ou chronique.

On peut évoquer trois niveaux: le seuil de patence, le seuil clinique et, dans les infections à P. falciparum, le seuil de danger du paludisme pernicieux.

Seuil de patence et seuil clinique en région endémique

En Afrique au sud du Sahara, la parasitémie peut être observée chez 60 à 70 p.100 de la population saine lors d'un seul examen en GE et chez presque 100 p.100 des individus si des examens répétés sont pratiqués. Les parasitémies en dessous de 10.000/µl ne sont pas souvent symptomatiques et lorsqu'on les découvre chez des patients fébriles, on recherche une autre étiologie. Cette densité seuil de 10.000/µl représente 0,2 p.100 de globules rouges parasités (environ 2 par champ dans un frottis). La tolérance est variable d'un sujet à l'autre, elle se situe généralement entre 5.000 et 15.000 parasites par µl.

De façon générale, il existe une corrélation entre la parasitémie et l'apparition des signes cliniques et leur gravité. Cependant les enfants et, dans une moindre mesure les adultes, peuvent dans les régions africaines, tolérer des parasitémies très élevées sans présenter de symptômes cliniques. Au Niger, Rougemont a observé des parasitémies de plus de 100.000/µl chez des sujets non fébriles!

Chez les personnes non immunes, des parasitémies faibles peuvent donner lieu à des phénomènes pathologiques.

Seuil de gravité

En l'absence d'immunité surtout, la corrélation entre la densité parasitaire de P. falciparum et la gravité des symptômes est nette. La grande majorité des patients avec malaria cérébrale ont une hyperparasitémie.
Chez les enfants atteints de malaria cérébrale, les parasitémies qui excédent 1 million/µl (20 p.100 de G.R. parasités) sont associées de manière significative à une issue fatale.

Dans les régions où le paludisme n'est pas stable (endémicité fluctuante, prémunition peu efficace), les patients infectés par P.falciparum et présentant plus de 100.000 parasites par µl (plus de 250 parasites par champ de GE ou 2 p.100 de globules rouges parasités) nécessitent une attention particulière, surtout si l'hématocrite est bas.

Méthodes d'enrichissement

Une technique basée sur une centrifugation différentielle et le fait connu que l'acridine orange colore les cellules contenant de l'acide nucléique y compris les plasmodiums, a été proposée par Becton-Dickinson sous le nom de "quantitative buffy coat" (QBC, voir chapitre 19).

Dans le tube QBC (capillaire tapissé d'acridine orange, d’un anticoagulant et muni d'un flotteur) et après centrifugantion, les hématies contenant des trophozoïtes sont concentrées au dessus des hématies non parasitées, au niveau du flotteur et étalées autour de celui-ci contre la paroi du capillaire. Les parasites apparaissent nettement sous éclairage ultraviolet grâce à l'émission, par le noyau du parasite, de lumière fluorescente. Le pigment malarien est bien visible sous forme de granules foncés dans les phagocytes ou dans les parasites eux-mêmes et contraste avec la fluorescence de la chromatine nucléaire.

Le principal avantage de la méthode QBC par rapport à la GE est certainement la rapidité des manipulations et de la lecture. Par ailleurs, le volume examiné étant de 60 µl de sang, on peut s'attendre à une meilleure sensibilité par rapport à la GE (où 500 champs examinés équivalent à 1,2 µl). Cependant les auteurs qui ont testé la méthode ne sont pas tous d'accord sur ce point.

Méthodes d'introduction récente

Elles permettent la reconnaissance de molécules spécifiques du parasite.

Détection d'antigènes de plasmodium

Des anticorps monoclonaux permettent la détection et de l'identification des agents pathogènes. La détection d'un antigène parasitaire (produit du métabolisme ou de la lyse parasitaire, soluble dans le plasma) témoigne d'une infection actuelle de façon plus rapide et plus sensible que la microscopie. Elle devrait pouvoir identifier le parasite avec précision et théoriquement distinguer non seulement l'espèce plasmodiale mais aussi des sous-populations à l'intérieur d'une même espèce.

Antigènes solubles de formes asexuées sanguines dans le plasma

Depuis quelques années, de nombreuses protéines de stades schizogoniques ont été décrites et les anticorps monoclonaux correspondants s'accumulent. Cependant, les molécules utiles sont des peptides (épitopes) provenant de la scission des protéines natives du parasite et dénaturées au cours des manipulations d'extraction.

Face à une telle abondance de réactifs monospécifiques différents, il faudra attendre pour qu'une hiérarchie apparaisse dans leur valeur respective pour le diagnostic du paludisme aigu ou des infections inapparentes
.
Une capture d’antigène riche en histidine (“histidine-rich protein”, HRP-II) de P. falciparum a cependant été essayée par Becton-Dickinson sous forme d’un “dip-stick test” (ParaSight F®). Il s’agit d’un bâtonnet en fibres de cellulose, imprégné d’un IgG1 monoclonal dirigé contre un peptide synthétique constitutif de la protéine. Ce bâtonnet est d’abord trempé dans un échantillon de sang hémolysé du sujet suspect de paludisme et ensuite dans un sérum polyclonal anti-HRP-II conjugué à des liposomes contenant un colorant rose. Par rapport à la microscopie, la sensibilité du test est de 58 p.100 pour des parasitémies moyennes de 63 parasites/µl et de 90 à 100 p.100 pour des parasitémies moyennes de 1290 parasites/µl.

Antigènes figurés dans le sang

La recherche de parasites au microscope peut se faire après une réaction d'immunofluorescence. Le test "monofluo kit" pour détection de P. falciparum est commercialisé par l'Institut Pasteur, Paris.
L'utilité n'est pourtant pas évidente car le temps consacré à la préparation est considérable et le gain de sensibilité n'est pas significatif par rapport à la GE colorée au Giemsa.

Recherche de matériel génique dans un prélèvement

Sondes nucléiques

Le choix judicieux des séquences de nucléotides permettra en théorie, dans l'avenir, le repérage dans un prélèvement (sang parasité) des différentes espèces de plasmodium ou même d'une lignée possédant des caractères particuliers, par exemple la résistance à un médicament antipaludique. Ces séquences constituent des réactifs très spécifiques à condition d'avoir une longueur suffisante.

Une sonde à P. falciparum décèle régulièrement des parasitémies de 500/µl. Dans une étude comparative par rapport à la microscopie, la sensibilité d'une sonde a été de 65 p.100.

L'amplification génique (“polymérase chain reaction", PCR)

La PCR, beaucoup plus sensible, amplifie les séquences reconnues et les rend facilement repérables. L'amplification génique n'est pas encore évaluée dans le diagnostic du paludisme (ou plutôt dans la détection de plasmodiums dans un prélèvement, ce qui est très différent, on l'a vu, du diagnostic du paludisme clinique!). Il restera à déterminer dans quel cas, mis à part les contrôles de sang de transfusion en dehors des zones d’endémie et certains programmes de recherche pointus, il est nécessaire et utile de s'assurer que la dernière trace de parasite a disparu du sang d'un sujet.

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Sérologie

Antigènes et réactions utilisés

Protéines constitutives du parasite ou produits excrétés de son métabolisme, chacun des quelques 30 antigènes de plasmodium a une localisation qui lui est propre: cytoplasme ou membrane du parasite et de l'érythrocyte parasité, plasma.

Ces antigènes peuvent actuellement être séparés et purifiés chimiquement, après destruction du parasite.

Antigènes de sporozoïtes

Une fraction antigénique purifiée de sporozoïte est maintenant disponible. C'est un épitope de la protéine "circumsporozoïtique" (CSP, déjà citée dans le paragraphe traitant des antigènes de plasmodium), utilisé avec succès par les épidémiologistes dans une réaction immuno-enzymatique pour titrer chez les sujets exposés aux piqûres infectantes, les anticorps spécifiques dirigés contre les sporozoïtes. Ces antigènes ne sont pas utiles pour le diagnostic d'un accès clinique mais ils donnent un renseignement précis d'ordre épidémiologique (fréquence des inoculations de sporozoïtes).

Antigènes de la schizogonie érythrocytaire

Ce sont les antigènes des formes asexuées du sang qui sont utilisés en routine clinique ou épidémiologique puisque c'est ce stade qui provoque les symptômes par sa prolifération et celui qui persiste chez le sujet asymptomatique immun.

Parmi les protéines déjà connues des formes sanguines, il n'en existe aucune qui puisse à elle seule, jusqu'à présent, jouer le rôle d'antigène de diagnostic précoce d'une infection plasmodiale. On continue donc à utiliser, en sérologie de routine, des parasites entiers, sous forme d'antigène figuré (intacts morphologiquement) ou de solutions de protéines parasitaires (parasites détruits et repris en solution dans un tampon).

Pour un diagnostic sensible et spécifique de l'infection plasmodiale, on est obligé de choisir, en outre, l'espèce qui a le plus de chance d'être en cause (réaction homologue). D'où la nécessité de doser les anticorps vis-à-vis de plusieurs espèces parasitaires (idéalement, les quatre espèces de parasites de l'homme) s'il s'agit, comme dans les centres de transfusion sanguine de régions non endémiques, de garantir l'absence de plasmodiums humains dans le sang des donneurs .

Dans la pratique, les schizontes endo-érythrocytaires de P. falciparum peuvent être obtenus par maturation synchrone in vitro (cultures continues) tandis que les parasites de la schizogonie érythrocytaire de P. vivax, P. ovale ou P. malariae , qui ne sont pas cultivables, doivent être récoltés chez des patients atteints de paludisme aigu. A défaut de patients ou de cultures, il est également possible de recourir à des infections expérimentales d'animaux splénectomisés (singe Aotus pour P. falciparum, P. vivax et P. malariae, chimpanzé pour P. ovale ).

Réactions utilisées

L'immunofluorescence indirecte (IFI), l’hémagglutination passive et les tests immuno-enzymatiques du type ELISA sont actuellement les plus utilisés.

Ces trois techniques, dans l'état actuel des préparations antigéniques, sont grossières et décèlent un contact global, passé ou présent, de l'organisme avec les parasites. La mosaïque antigénique est présentée en vrac soit sous forme d'antigène figuré (plasmodiums en frottis ou étalement plus épais, sur une lame), soit sous forme d'un antigène soluble (mélange de protéines parasitaires en solution aqueuse).

Utilité des méthodes sérologiques

La présence de plasmodiums dans l'organisme d'un sujet est à l'origine de la synthèse d'anticorps dirigés contre les antigènes de ce parasite. Le nombre et la diversité, déjà mentionnés, des antigènes dans les stades de la schizogonie érythrocytaire compliquent l'interprétation de la réponse immune. D'autre part, les caractéristiques mêmes de cette réponse immune limitent l'utilité pratique de la sérologie dans le domaine du diagnostic.

La quantité d'anticorps dosée par les méthodes sérologiques sera proportionnelle à l'intensité et à la durée de l'infection. La sérologie est plus sensible que la mise en évidence du parasite car elle est indépendante des fluctuations à court terme de la parasitémie et reste positive en cas de parasitémie subpatente. De ce fait, l'existence dans les pays endémiques de très nombreux porteurs asymptomatiques de parasites, jouissant à l'âge adulte d'une immunité protectrice induite par un contact prolongé et contemporain avec le parasite, y anéantit la valeur diagnostique des tests sérologiques.

Dans l'accès de paludisme clinique, l'abondance de parasites dans le sang facilite l'examen microscopique, toujours péremptoire, et produit, après un délai variable, une élévation du titre d'anticorps anti-stades de la schizogonie érythrocytaire. Lors d'une primo-infection, les anticorps ne deviennent en effet décelables que lorsque la parasitémie a atteint, depuis plusieurs jours, des niveaux cliniques . Ce délai n'est pas observé lors d'une réinfection.

La sérologie possède cependant trois indications précises:

• dans les cas de fièvre d'origine indéterminée. Lorsque le patient a suivi une chimioprophylaxie irrégulière d'efficacité douteuse ou que le traitement curatif a été commencé sans attendre le prélèvement, la parasitémie peut être masquée. La constatation d'un titre élevé d'anticorps précisera souvent la cause de la fièvre, tandis que leur absence permettra d'exclure l'étiologie malarienne.
  
• dans les centres de transfusion sanguine des zones non endémiques. Les donneurs de sang ayant voyagé récemment pourront être porteurs de parasites en dehors d'accès francs. Dans ce cas aussi, il s'agira d'exclure la présence d'une parasitémie asymptomatique et souvent subpatente.
• dans les études épidémiologiques. Le titre moyen d'anticorps anti-formes asexuées sanguines dans un échantillon de population permet d'évaluer l'intensité du contact avec les parasites, qui lui-même est tributaire de la transmission locale.

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7.3 LE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE NON SPECIFIQUE

Il est utile surtout pour surveiller l'apparition des formes graves. Les chiffres donnés entre parenthèses sont des cotes d'alerte laissant présager des complications d'une extrême gravité!

Anémie hémolytique

L'hémolyse est présente dans tous les cas de paludisme. Même le paludisme viscéral évolutif, d'allure chronique, déterminera une hémolyse avec anémie grave d'installation progressive. L'anémie de type hémolytique est donc constante.

D'importance variable, normochrome ou hypochrome, elle est mise en évidence par le dosage de l'hémoglobine (< 7 g/dl), la mesure de l'hématocrite ou la numération des hématies. Ces valeurs pourront être faussées par l'existence d'une hémoconcentration mise en évidence par le dosage du sodium plasmatique. La numération des réticulocytes est très utile pour déceler une anémie en cours de régénération.

Le dosage d'urobilinogène dans l'urine confirmera l'hémolyse. Dans le plasma, on recherchera la diminution de l'haptoglobine (utilisée pour fixer l'hémoglobine libre et former avec elle de grosses molécules métabolisées par la rate et le foie) et l'augmentation de la bilirubine.

Glycémie

Le paludisme grave à P. falciparum cause une hypoglycémie, aggravée par l'effet hypoglycémiant de la quinine. On surveillera la glycémie (< 0,40 g/l).

Paramètres hépatiques

Les altérations de la fonction hépatique sont courantes dans le paludisme aigu. Généralement sans extérioration clinique, elles peuvent être recherchées par le dosage des enzymes habituels: élévation de la lactate déshydrogénase (LDH) et de la glutamate pyruvate transaminase (SGPT). Le rapport albumine/globuline sériques est fortement abaissé du fait du déficit de la synthèse de l'albumine combinée à une hyperproduction d'immunoglobulines.

Le cholestérol est presque toujours diminué et les triglycérides augmentés dans les premiers jours de l'accès. Il faut quelques semaines pour la normalisation après traitement.

Paramètres rénaux

La fonction rénale devra donc être surveillée par le dosage de l'urée (> 0,60 g/l) ou de la créatinine plasmatique (> 30 mg/l). C'est dans le paludisme au long cours ou chronique que ces phénomènes sont les plus marqués. P. malariae est parfois responsable d'un syndrome néphrotique qui se caractérise par une albuminurie élévée accompagnée d'une hypo-albuminémie (< 30 g/l).

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